1. 簡介

Runx2（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2早期稱為核心結(jié)合因子α-1（Cbfa1））是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）成骨細(xì)胞分化和骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子。在 Runx2 中具有純合突變的小鼠表現(xiàn)出胚胎牙齒發(fā)育停滯，由于缺乏成骨細(xì)胞分化而沒有膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化，并且是胚胎致命的。Runx2 被體內(nèi)小鼠皮質(zhì)骨中的流體剪切應(yīng)力激活，據(jù)報道拉伸和流體剪切應(yīng)力等機械應(yīng)力可增強成骨細(xì)胞中 Runx2 的表達(dá)并促進(jìn)其在體外成骨細(xì)胞分化。這些發(fā)現(xiàn)表明，Runx2調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)以形成骨。然而，Runx2在機械應(yīng)力誘導(dǎo)的骨形成中的生物學(xué)功能的潛在機制尚未闡明。

在本研究中，我們研究了Runx2在機械拉伸誘導(dǎo)骨重塑中的功能，通過在Runx2中對牙齒施加正畸力+/?小鼠，CCD的動物模型。我們研究了Runx2中的增殖和成骨細(xì)胞分化+/?實驗牙齒運動的張力側(cè)小鼠，以及源自Runx2的拉伸BMSC中的小鼠+/?小 鼠。最后，我們研究了mTORC2在Runx2中BMSC的機械拉伸誘導(dǎo)增殖和成骨細(xì)胞分化中的激活+/?小 鼠。

2. 材料和方法

2.7. 細(xì)胞培養(yǎng)

后，股骨和脛骨為6-9周齡野生型和Runx2+/?仔細(xì)清除小鼠貼壁軟組織中的細(xì)胞并收獲骨髓細(xì)胞。收集的細(xì)胞以4×10的密度接種7每3.5厘米組織培養(yǎng)的細(xì)胞并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)：Dulbecco的改良Eagle中低葡萄糖含有10%熱滅活胎牛血清和青霉素/鏈霉素，在 37 °C 的 5% CO 中2 大氣層。培養(yǎng)4天后，去除非貼壁細(xì)胞，再培養(yǎng)貼壁細(xì)胞3天，直到90%匯合，在本研究中用作BMSC。為了促進(jìn)成骨，BMSCs在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)：補充有10nM地塞米松（Sigma），82μg/ ml l-抗壞血酸（Wako）和10mM β-甘油磷酸鹽（Sigma）的生長培養(yǎng)基，在37°C的5%CO2大氣層。每三天更換一次成骨培養(yǎng)基。

2.8. 機械拉伸在細(xì)胞上的應(yīng)用

BMSCs在10厘米上播種在細(xì)胞拉伸腔室，涂有0.05mg / ml纖連蛋白（Sigma）并以12×1的密度培養(yǎng)10小時5細(xì)胞/厘米2.在細(xì)胞達(dá)到亞匯合后，使用專門設(shè)計的裝置拉伸它們，該裝置使腔室寬度單軸增加12%。拉伸值是根據(jù)拉伸誘導(dǎo)的BMSC增殖數(shù)據(jù)確定的。在使用抑制劑的情況下，在與抑制劑孵育1小時后拉伸細(xì)胞。未拉伸的細(xì)胞在相同條件下孵育并用作對照。

3. 結(jié)果

3.3. 拉伸對野生型和Runx2中BMSC增殖的影響+/?小 鼠

在牙齒運動的張力側(cè)，PDL中招募的MSC在牙槽骨表面迅速增殖，并啟動成骨細(xì)胞的分化（Pavlin和Gluhak-Heinrich，2001）。 然后發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)的礦化并促進(jìn)骨形成（Pavlin和Gluhak-Heinrich，2001）。闡明Runx2中牙齒運動張力側(cè)骨形成減少的機制+/?小鼠，我們拉伸小鼠BMSC并在體外檢查拉伸誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞功能。我們檢查了野生型和Runx2中的DNA含量+/?拉伸后的BMSCs評估Runx2是否與成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞的增殖有關(guān)。未拉伸（對照）野生型和Runx2中的DNA含量+/?BMSC增加并在機械負(fù)荷開始后48小時達(dá)到峰值（圖4A）。卸載野生型和Runx2之間的DNA含量沒有顯著差異+/?BMSC從0到48小時（圖4A）。在野生型BMSC中，機械刺激在拉伸12和24小時時顯著增加了DNA含量，在24小時達(dá)到峰值（圖4A）。同時，來自Runx2的DNA含量+/?BMSC在12和24小時拉伸顯著增加，并在36小時觀察到峰值（圖4A）。Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSC在24 h時表現(xiàn)出顯著降低拉伸誘導(dǎo)的DNA含量增加，而拉伸野生型和Runx2+/?BMSC在12、36和48小時沒有差異（圖4A）。此外，我們使用CCK-8進(jìn)一步定量評估了BMSC的細(xì)胞增殖。在機械負(fù)荷開始2小時后，機械拉伸增加了野生型和Runx<>的增殖+/?BMSC，更重要的是拉伸的Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSC顯著增殖。

細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cdks）是驅(qū)動細(xì)胞周期的生長因子介導(dǎo)信號的整合因子（Baldin等人，1993;林和卡爾迪斯，2013 年）。生長因子促進(jìn)細(xì)胞周期的G1期，D型細(xì)胞周期蛋白主要作為生長因子傳感器（Baldin等人，1993;林和卡爾迪斯，2013 年）。p21和p27是細(xì)胞周期蛋白D-cdk4復(fù)合物的緊密結(jié)合抑制劑并抑制G1進(jìn)展（Harper等人，1993;波利亞克等人，1994年）。我們評估了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在野生型和Runx2中的表達(dá)+/?在拉伸開始后6和12小時BMSC檢查細(xì)胞周期進(jìn)程與拉伸的關(guān)聯(lián)。細(xì)胞周期蛋白D在未拉伸的野生型和Runx2中得到增強+/?BMSC在12小時與0小時相比（圖4B）。拉伸在野生型BMSC中6小時和Runx2中顯著誘導(dǎo)的周期蛋白D+/?12小時的BMSCs（圖4B）。 p21蛋白在未拉伸的野生型和Runx2中的表達(dá)+/?BMSCs從0到6小時沒有變化，但從6小時減少到12小時，盡管Runx2+/?無論機械負(fù)荷如何，BMSC在21至0 h期間的p12表達(dá)都明顯高于野生型BMSC（圖4B）。在野生型BMSC中，拉伸減弱p21在6小時時表達(dá)，但在12小時時不表達(dá)，而在Runx2+/?BMSC，在21和6小時拉伸減弱p12表達(dá)（圖4B）。從27到0小時，BMSCs中p12表達(dá)幾乎沒有差異，無論負(fù)載和Runx2基因劑量如何（圖4B）。

這些發(fā)現(xiàn)表明，拉伸增加了BMSC的增殖并調(diào)節(jié)了細(xì)胞周期進(jìn)程，而Runx2基因劑量的減少延遲了機械刺激誘導(dǎo)的BMSCs增殖。

3.4. 拉伸對野生型和 Runx2 BMSC 成骨的影響+/?小 鼠

接下來，我們將拉伸加載到野生類型和 Runx2 上+/?成骨培養(yǎng)基中的BMSCs，研究Runx2對牽伸誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化的影響。在未拉伸的野生型和 Runx2+/?BMSCs，ALP活性，一種早期成骨標(biāo)志物，在拉伸開始后0至21天逐漸增加，此后下降，直到第28天，兩種基因型之間沒有顯著差異（圖4C）。在野生型BMSC中，拉伸在第7天和第14天顯著增加了ALP活性，并且在第7天ALP活性達(dá)到峰值（圖4C）。在 Runx2 中+/?BMSC，機械刺激在第14天顯著增強了ALP活性，但在第7天沒有，并且在第21天觀察到ALP活性的峰值。此外，雜合子Runx2缺乏癥在第14天顯著降低了BMSC中拉伸誘導(dǎo)的ALP活性（圖4C）。拉伸誘導(dǎo)的 Runx2 中 ALP 活性峰值+/?BMSC顯著低于野生型BMSCs（圖4C）。

機械負(fù)荷在拉伸開始后第14天顯著增加了野生型BMSC中的OSC mRNA表達(dá)，拉伸誘導(dǎo)的OSC mRNA表達(dá)在第21天達(dá)到峰值，此后下降（圖4D）。相反，拉伸顯著誘導(dǎo)了Runx2中的OSC mRNA表達(dá)+/?BMSC在第21天，但不在第14天（圖4D）。Runx2+/?BMSC的拉伸誘導(dǎo)OSC mRNA表達(dá)峰明顯低于野生型BMSCs（圖4D）。

我們進(jìn)一步研究了拉伸誘導(dǎo)的基質(zhì)沉積鈣，這是成骨的晚期標(biāo)志物，在野生型和Runx2的BMSC中+/?小鼠（圖4E）。在卸載的百搭型和 Runx2 中+/?BMSCs，鈣含量持續(xù)增加，直到拉伸開始后第28天，但野生型和Runx2之間沒有顯著差異+/? (圖4機械負(fù)荷在第21天和第28天以及Runx2中顯著提高了野生型BMSC的鈣含量。+/?BMSC在第28天，但不在第21天（圖4E）。第28天，Runx2中拉伸誘導(dǎo)的鈣含量+/?BMSC明顯低于野生型BMSC（圖4E）。

此外，野生型和Runx2+/?BMSC在機械刺激開始后第7天染色ALP，第21天染色茜素紅（圖4F和G）。拉伸導(dǎo)致兩種基因型的ALP和茜素紅色顯著染色（圖4F和G）。未拉伸和拉伸的 Runx2+/?BMSC的染色率低于相應(yīng)的野生型BMSC（圖4F和G）。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)拉伸增強了野生型和Runx2的成骨作用。+/?BMSC，但 Runx2+/?與野生型BMSC相比，BMSCs顯示出拉伸誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化減少和延遲。

3.5. 肺泡骨張力側(cè)成骨細(xì)胞中的 mTOR 和 Rictor 蛋白表達(dá)

評估m(xù)TORC2與Runx2中牙齒運動延遲張力側(cè)骨形成的相關(guān)性+/?小鼠，我們在實驗牙齒運動的張力側(cè)檢查了成骨細(xì)胞中mTOR和Rictor的蛋白質(zhì)表達(dá)。

在開始實驗牙齒移動之前（第0天），mTOR和Rictor在PDL中以野生型和Runx2表達(dá)+/?老鼠，雖然 Runx2+/?與野生型同窩小鼠相比，小鼠表現(xiàn)出兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)較弱（圖5H，N，h和n，箭頭）。在實驗性牙齒運動的第1天和第3天，在野生型小鼠實驗牙齒運動的張力側(cè)檢測到成骨細(xì)胞中mTOR和Rictor表達(dá)增強（圖5J，P，L和R，箭頭），而Runx2+/?小鼠在第3天表現(xiàn)出這些蛋白質(zhì)的較弱表達(dá)（圖5j，p，l和r，箭頭）。在Runx2成骨細(xì)胞中未檢測到mTOR和Rictor的表達(dá)+/?第1天的小鼠（圖5i，j，o和p）。我們在牙齒運動開始后的第3天使用野生型小鼠作為陰性對照，并且沒有表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。

5. 結(jié)論

我們證明了Runx2中的牙齒移動延遲+/?小鼠與野生型小鼠的比較。這促使我們使用 Runx2+/?小鼠作為RUNX2CCD患者延遲正畸牙齒運動的模型+/?.此外，我們還展示了 Runx2+/?BMSCs減少拉伸誘導(dǎo)的增殖，并通過mTORC2激活分化為成骨細(xì)胞。我們的研究結(jié)果表明，Runx2與mTORC2 / Akt激活的關(guān)聯(lián)是牙齒運動過程中拉伸誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵作用之一。

CELL TANK

國產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)

技術(shù)背景：

當(dāng)前細(xì)胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實際“動態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化、細(xì)胞間相互作用與體內(nèi)動態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)以及基因蛋白表達(dá)改變等。

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CellTank一體式細(xì)胞牽張拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)

CELL TANK為細(xì)胞和組織模型提供機械拉伸條件的平臺。
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國產(chǎn)細(xì)胞牽張損傷控制儀國產(chǎn)細(xì)胞牽張損傷控制儀

預(yù)埋橫桿式培養(yǎng)腔室

拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm

細(xì)胞應(yīng)力加載培養(yǎng)系統(tǒng)

可視化圖形操作界面

HOW TO USE

1. 細(xì)胞外基質(zhì)涂層進(jìn)行預(yù)處理，將細(xì)胞接種到腔室中，細(xì)胞粘附在基底上，開始過夜培養(yǎng)過程。

2. 細(xì)胞增殖后，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。

3.  根據(jù)實驗?zāi)繕?biāo)收獲/處理細(xì)胞，分析數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢

· 均勻負(fù)載
培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù)，保證每個細(xì)胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變，非軸向方向上的次級載荷極低
· 高再現(xiàn)性
高精度步進(jìn)電機保證在各種速度和拉伸比組合中實現(xiàn)一致的運動程序，機械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激
· 一體式控制
自帶觸摸控制屏，無需電腦。內(nèi)置ARM芯片，高效穩(wěn)定運行的同時簡單易用
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靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形
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有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實驗室分析技術(shù)，包括細(xì)胞固定和熒光成像等

設(shè)備參數(shù)

橫桿拉伸技術(shù)局部應(yīng)變率更均勻

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